La tecnologia DEParray, fiore all’occhiello della start-up bolognese Silicon Biosystem, a poco più di un anno dalla sua ultima evoluzione con il DEParray-Nxt, amplia la sua sfera di applicazione, fino a comprendere le attività investigative sulla scena del crimine. La stretta sinergia collaborativa fra i Carabinieri Ris di Roma e il gruppo Menarini, di cui la Silicon entra a far parte nel 2013, ha portato infatti, alla nascita di un nuovo utilizzo in ambito investigativo, di questa interessante tecnologia. Il lavoro scientifico, pubblicato sulla rivista “Forensic Science International” dal titolo “Isolation and genetic analysis of pure cells from forensic biological mixtures: The precision of a digital approach” e quello precedente pubblicato su “Scientific Reports di Nature” dal titolo “Digital Sorting of Pure Cell Populations Enables Unambiguous Genetic Analysis of Heterogeneous Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tumors by Next Generation Sequencing”, ci consentono di apprezzarne i dettagli e l’affidabilità nei risultati.

L’idea

Tutto ha inizio con la tesi di laurea di Gianni Medoro, giovane studente pugliese in ingegneria elettronica, presso l’Università degli studi di Bologna. La tesi verte su una nuova tecnologia ibrida a metà strada fra biologia cellulare, microfluidica e microelettronica, in grado di isolare le cellule tumorali, presenti nel torrente circolatorio. Il progetto è innovativo, avvincente e dalle forti potenzialità. Gianni Medoro ha l’intuizione e con il collega Nicolò Manaresi, getta le basi per la costituzione di una start-up. Nasce così, Silicon Biosystems srl che, grazie anche all’ingresso nel team di una figura d’esperienza come Giuseppe Giorgini ( ex Ceo dell’americana Amgen), inizia ad attrarre investitori. L’azienda si trasforma in Spa e i finanziamenti, in particolare da parte di Intesa San Paolo, Innogest e Focus Gestioni del Gruppo Banca Marche, iniziano ad arrivare. Solo fra il 2007 e il 2011 vengono investiti in ricerca 10,2 milioni di euro e i brevetti dell’azienda toccano quota 28.  Nel 2013 la Silicon Biosystems, entra a far parte del colosso farmaceutico toscano fondato da Alberto Aleotti e la tecnologia DEParray, diventa, un prodotto automatizzato ad altissima tecnologia, venduto ormai, nei centri di ricerca e diagnostica di tutto il mondo.

Il funzionamento

L’etimologia dei due acronimi che compongono il termine DEParray, riconduce alla funzionalità della tecnologia stessa. L’acronimo Dep infatti sta per Dielettroforesi (dall’inglese “dielectrophoresis“), mentre Array termine informatico di radice anglosassone, sta ad indicare una struttura dati, ovvero una sorta di contenitore, un insieme (appunto array in inglese) le cui caselle sono dette celle (o elementi) dell’array stesso. La tecnologia DEParray, in pratica, consente la separazione e l’isolamento di materiale cellulare misto, utilizzando un microchip che permette di intrappolare le singole cellule, costituenti il campione biologico iniziale, in gabbie dielettroforetiche ( il substrato di migrazione non è quindi il gel di poliacrilammide e agarosio, come avviene nel normale processo di frazionamento del DNA  per elettroforesi ) creando un campo elettrico al di sopra di un sottoinsieme di elettrodi in array. Le singole cellule, costituenti il campione iniziale riescono così, ad essere perfettamente individuate e isolate e grazie a tecniche di immunofluorescenza, marcate  ed infine rappresentate sul monitor, come fossero pixels di colore diverso. L’array di elettrodi del microchip è capace, infine, di far muovere ciascuna cellula di interesse, individualmente e simultaneamente dalla posizione iniziale sino al punto di recupero.

(a) Simultaneous detection of two distinct cell populations based on antigen expression from a dissociated FFPE specimen by using the mean intensity keratin-Alexa488 vs vimentin-Alexa647 scatter plot. (b) After gating for the vimentin-positive (V + ) and keratin-positive (K + ) cell populations, single-parameter DNA histograms are generated. The V + fraction is used as an internal DNA-diploid reference for K + population DNA content assessment. (c) Images of individual events can be viewed on an image bar, allowing cells of interest to be identified and flagged for recovery. ( Fonte – Pub. Nature-Scietific Reports : « Digital Sorting of Pure Cell Populations Enables Unambiguous Genetic Analysis of Heterogeneous Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tumors by Next Generation Sequencing » )

La metodologia DEParray, consente quindi, di eliminare quel “rumore di fondo”, ovvero quelle cellule non desiderate ed in particolare, “quel materiale genetico non desiderato”, normalmente presente nei campioni tissutali FFPE formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections,  usati in elettroforesi. La marcatura, con immunofluorescenza, degli anticorpi di superficie e la tecnologia dielettroforetica, combinata con la microelettronica array, consente, alle  cellule che giungono in provetta, al termine del processo di frazionamento DEParray, di essere “pure” al 100%, adatte quindi, ad una estrazione incontaminata del materiale genetico,

Ambiti di applicazione

Uno dei principali ambiti di applicazione del DEParray è senza dubbio quello diagnostico oncologico. La tecnica, definita altresì “biopsia digitale” consente infatti, l’apprezzamento, l’individuazione e l’isolamento di  cellule maligne presenti in campioni ematici liquidi, in tessuti molli e solidi. La metodica consente inoltre il rilevamento di cellule tumorali, anche quando la loro presenza è particolarmente esigua nel tessuto e quindi in uno stadio iniziale della malattia, garantendo una diagnosi precoce e quindi una terapia mirata e tempestiva. Il passaggio successivo all’isolamento delle cellule tumorali, infatti è la mappatura del genoma, al fine di poter definire una terapia oncologica adeguata e personalizzata. La particolarità del metodo, consente inoltre, la sua applicazione anche in altri ambiti, quali la “diagnostica prenatale non invasiva” proprio perché garantisce la perfetta separazione delle cellule del feto da quelle della madre. Il processo analitico, parte da una semplice goccia di sangue, rendendo obsoleta l’amniocentesi, ovvero il prelievo di liquido amniotico dal sacco uterino. Ultima applicazione, in termini temporali, anche se non per importanza è infine l’indagine forense.

DEParray nell’indagine forense

Una delle difficoltà maggiori che si hanno, nel processo investigativo sulla scena di un crimine è quello di risalire al profilo genetico delle persone coinvolte, partendo da singoli campioni di dna. Spesso però le cose non sono così semplici, come si possa immaginare, osserva la Dr.ssa Francesca Fontana, Biologa, responsabile ricerca Menarini, nonché co-autrice di alcune pubblicazioni scientifiche sul metodo DEParray. I campioni da analizzare, che giungono nel laboratorio dei Carabinieri RIS ( Reparto Investigazioni Scientifiche ), il più delle volte sono misti, ad esempio costituiti da cellule del sangue, epiteliali, spermatiche e magari appartengono non solo ad un individuo ma a due o più individui. In questo caso l’analisi del DNA non riesce ad individuare con esattezza il profilo genetico di ogni contributore, e si deve ricorrere all’analisi statistica. La tecnologia DEParray, ancora una volta, corre in aiuto degli inquirenti, garantendo la separazione delle singole cellule presenti nel campione misto iniziale e consentendo quindi, la mappatura del genoma di ciascuna cellula e in definitiva, l’esatta individuazione del profilo genetico di tutte le persone eventualmente coinvolte nel crimine.

Nel paper pubblicato su Forensic Science International: Genetics, per dimostrare la validità dell’approccio DEPArray nella risoluzione delle misture forensi, vengono descritte tre fasi di lavoro:

1. L’analisi di misture biologiche simulate, ovvero riprodotte in laboratorio
2. La dimostrazione della riproducibilità dei dati genetici ottenuti dalle cellule isolate tramite DEPArray.
3. L’applicazione a tracce relative ad un caso reale di violenza sessuale.

L’analisi delle misture simulate, ha dimostrato l’assoluta affidabilità del procedimento, con il 100% di corretta identificazione dei fluidi biologici campionati e dei corrispettivi profili genetici. Nella seconda parte del lavoro viene dimostrato che i risultati ottenuti dall’analisi genetica delle cellule recuperate con DEPArray sono statisticamente identici a quelli ottenuti da quantità paragonabili di DNA. Questo aspetto, che a prima vista potrebbe apparire trascurabile è in realtà estremamente importante: infatti  la caratterizzazione effettuata, dimostra che le tecniche attualmente in uso per l’analisi del DNA, e quindi riconosciute dagli standard internazionali, ed ammesse in tribunale, sono applicabili anche su cellule isolate da DEPArray, e che i risultati generati sono ugualmente attendibili. Nell’ultima fase della pubblicazione, infine, viene descritto come, a seguito di queste caratterizzazioni, si siano potuti analizzare campioni reali, inerenti il caso di una violenza sessuale. Le analisi sui campioni, hanno consentito l’individuazione e il perfetto isolamento dalla traccia mista, dei gameti maschili e quindi di risalire al profilo genetico dell’indagato. L’esito di questa terza fase del paper ha dato conferma che l’approccio scientifico proposto, può essere utilizzato con successo, non solo su tracce simulate ma anche su quelle reali.